LE MICORRIZE
Le micorrize sono un'associazione simbiotica mutualistica che si stabilisce tra le radici delle piante ed alcuni funghi del suolo. A seconda delle particolari strutture anatomiche e del tipo di fungo e pianta si possono distinguere differenti tipi di associazioni micorriziche. Tradizionalmente le micorrize vengono distinte in ectomicorrize, quando il fungo si sviluppa nella radice dell'ospite negli spazi esistenti tra le cellule attraverso ife intercellulari, e in endomicorrize quando il fungo cresce a livello intraradicale sviluppando strutture intracellulari (Smith e Read, 1997). Grazie a questo tipo di interazione, piante e funghi migliorano considerevolmente la loro nutrizione in quanto il fungo ha accesso ai carboidrati della pianta ospite (Hampp et al., 1995) e completa il suo ciclo vitale, mentre la pianta trae grande vantaggio nel suo sviluppo vegetativo grazie ad una migliorata nutrizione minerale (Smith e Read, 1997). Tra queste interazioni le più diffuse sono le micorrize arbuscolari (AM) che rappresentano l'oggetto della mia tesi e delle quali descriverò brevemente le caratteristiche.
Le micorrize arbuscolari (AM)
Le micorriziche arbuscolari sono le associazioni simbiotiche più diffuse in natura: esse interessano Angiosperme (circa l'80% delle specie), Gimnosperme, Pteridofite e alcune Briofite e hanno un'origine molto antica. Analisi di reperti fossili e di sequenze di DNA hanno infatti rilevato l'esistenza dei funghi AM più di 460 milioni di anni fa ed è stato ipotizzato che questi funghi abbiano contribuito alla colonizzazione delle terre emerse da parte delle piante (Redecker et al., 2000). I funghi AM sono biotrofi obbligati ed il loro ciclo vitale dipende dalla loro abilità di colonizzare le radici della pianta ospite. L'analisi di specifiche sequenze di DNA ha permesso nel 2001 di assegnare i funghi arbuscolari ad un nuovo phylum. Questo lavoro è stato eseguito analizzando la subunità corta del DNA ribosomiale (SSU rDNA) e, confrontando le sequenze, si è dovuto riconoscere l'esistenza di un nuovo phylum chiamato Glomeromycota (Schübler et al., 2001; Fig. 1.2).
Fig. 1.2 Albero filogenetico dei funghi AM basato sulle sequenze SSU rDNA (Schübler et al., 2001).
Lo studio mostra l'esistenza di un phylum, chiamato Glomeromycota, al quale appartengono quattro ordini (Archaesporales, Paraglomerales, Diversisporales e Glomerales) che comprendono in totale otto famiglie diverse (http://www.lrz-muenchen.de/~schuessler/amphylo/). Questa nuova tassonomia è stata resa possibile solo recentemente, quando circa 100 sequenze del DNA ribosomale di zigomiceti sono state rese disponibili nei database (O'Donnell et al., 2001; O'Donnell, Cigelnik e Benny, 1998; Tanabe et al., 2000) e le analisi filogenetiche hanno sempre prodotti gli stessi risultati: i funghi micorrizici arbuscolari rappresentano un phylum distinto che condivide un antenato comune con gli Ascomycota e i Basidiomycota (Fig. 1.2).
I funghi AM sono simbionti obbligati poichè riescono a completare il proprio ciclo vitale solo stabilendo una simbiosi con una pianta ospite. Durante l'interazione il fungo riceve dalla pianta composti del carbonio originati dal processo fotosintetico mentre le cede nutrienti minerali, in particolare fosfato. La simbiosi AM conferisce alle piante ospiti una maggiore tolleranza alla carenza idrica e a temperature estreme (Smith e Read, 1997) e protezione contro patogeni radicali (Pozo et al., 2002) e da inquinanti (Gonzalez-Chavez et al., 2004). Inoltre, la fase extraradicale dei funghi AM si estende nel suolo attraverso una rete di ife che contribuiscono a migliorare la stabilità degli aggregati del suolo (Rillig et al., 2004). I funghi micorrizici proprio per le loro caratteristiche biologiche di biofertilizzatori e biorisanatori, vengono considerati organismi di importanza prioritaria per la qualità dell'ambiente e per lo sviluppo di una agricoltura basata su una diminuzione dell'input chimico.
Nonostante il grande interesse per la simbiosi AM, i meccanismi molecolari alla base della formazione e del funzionamento di questa associazione restano per alcuni aspetti ancora sconosciuti. Tuttavia, studi di tipo genetico-molecolare condotti nell'ultimo decennio hanno fornito informazioni importanti che sono state argomento di numerosi articoli di revisione (Harrison, 2005; Bucher, 2007; Hause e Fester, 2005; Balestrini e Bonfante, 2005; Balestrini e Lanfranco, 2006; Reinhardt, 2007; Paszkowski, 2006).
Tappe della colonizzazione fungina
Il modo in cui le 150 specie di Glomeromycota, finora identificate, colonizzano più di 200000 specie di piante è decisamente conservato tra i diversi taxa.
Fase presimbiotica
L'interazione tra la pianta e il fungo inizia prima che avvenga il contatto fisico tra i due simbionti attraverso un dialogo molecolare probabilmente frutto di una lunga coevoluzione. In natura, i funghi AM sopravvivono sotto forma di spore multinucleate le quali, in assenza della pianta ospite, passano da uno stato di quiescenza alla germinazione producendo ife in grado di crescere solo per pochi giorni, data la loro natura di biotrofi obbligati. In vicinanza di una radice l'ifa germinativa cresce più rapidamente formando estese ramificazioni per massimizzare le possibilità di contatto con l'ospite (Buee et al., 2000; Giovannetti et al., 1993). Di recente le molecole bioattive presenti negli essudati radicali responsabili della ramificazione ifale sono state identificate e descritte come strigolattoni (Akiyama et al., 2005; Besserer et al., 2006). Esistono evidenze sperimentali anche dell'esistenza di un segnale diffusibile prodotto dal fungo che sarebbe importante nelle prime fasi dell'interazione AM. In analogia al Nod factor prodotto dai rizobi durante il processo di nodulazione (Albrecht et al., 1999; Catoira et al., 2000), tale segnale è stato chiamato "Myc factor". Questo fattore stimola, prima che avvenga il contatto tra i due simbionti, l'espressione del gene di Medicago truncatula MtENOD11 (Chabaud et al., 2002; Journet et al., 2001; Kosuta et al., 2003), un gene che viene indotto anche dal fattore Nod. Studi recenti dimostrano che un fattore diffusibile rilasciato costitutivamente dalle spore di funghi AM è in grado di generare un aumento transiente del calcio citosolitico in cellule in coltura (Navazio et al., 2007). Nel complesso questi risultati suggeriscono l'esistenza di fattori segnale fungini che permettono anche all'ospite vegetale di riconoscere il partner prima della penetrazione e suggeriscono un ruolo del calcio come messaggero intracellulare.
Fase simbiotica
La fase simbiotica vera e propria inizia quando un'ifa prende contatto con la radice di una pianta ospite, dove si differenzia a formare delle strutture tipo appressorio, chiamate ifopodi (Genre e Bonfante, 2007). La formazione dell'appressorio è accompagnata da cambiamenti dell'espressione genica, in particolare di geni associati a vie di segnalazione mediate dal calcio così come avviene durante le interazioni patosistiche (Breuninger e Requena, 2004). In seguito a questo evento, viene prodotta un'ifa specializzata per entrare e attraversare la cellula epidermica, evitando un contatto diretto tra la parete fungina e il citoplasma ospite grazie ad una membrana neoformata dalla cellula ospite.
Un ruolo importante nel processo di colonizzazione è giocato proprio dalla cellula epidermica contattata dal fungo. Osservazioni in vivo di componenti cellulari marcate con GFP hanno evidenziato che, prima della penetrazione da parte dell'ifa, la cellula epidermica organizza una struttura transiente, definita apparato di pre-penetrazione (PPA), con una nuova organizzazione citoscheletrica. Si ipotizza che il PPA abbia un ruolo fondamentale nell'elaborazione di un compartimento attraverso il quale il fungo cresce e penetra nel lume cellulare (Genre et al., 2005). Una volta che l'ifa penetra nella radice avviene la colonizzazione del parenchima corticale mediante la formazione di ife intercellulari e strutture intracellulari, quali i gomitoli e gli arbuscoli, caratterizzati questi ultimi da estese ramificazioni.
La formazione dell'arbuscolo, come l'ingresso nelle cellule epidermiche, è accompagnata da profondi cambiamenti nell'organizzazione della cellula ospite, come la frammentazione del vacuolo, la migrazione del nucleo dalla periferia al centro, la proliferazione degli organelli e la creazione di un comparto d'interfaccia. Le ife intracellulari, comprese quelle che costituiscono l'arbuscolo, sono infatti sempre circondate da un sottile strato di parete cellulare e dalla membrana plasmatica della cellula ospite. La costruzione di questa interfaccia da parte della cellula vegetale è realizzata attraverso la deposizione localizzata di materiale di parete (Balestrini e Bonfante, 2005) e l'espressione di geni specifici (Balestrini e Lanfranco, 2006). I rami arbuscolari aumentano notevolmente la superficie di contatto tra i due simbionti. Questa struttura è considerata la sede degli scambi nutrizionali. Dopo un breve periodo di vita (alcuni giorni) l'arbuscolo degenera, ma viene sostituito grazie alla continua formazione di nuovi arbuscoli (Bonfante, 2001). Anche il micelio extraradicale dopo un certo periodo di tempo degenera e le nuove spore prodotte sono rilasciate nel terreno, dove daranno inizio ad un nuovo ciclo di sviluppo.
L'intero processo di colonizzazione della radice è asincrono e le strutture dei primi stadi, come l'appressorio, coesistono con gli organi simbiotici, quali gli arbuscoli.
Si ritiene anche che dopo il collasso di un arbuscolo, la stessa cellula ospite può subire una nuova colonizzazione.
Fig. 1.3 Ciclo vitale di un fungo micorrizico arbuscolare (da Balestrini e Lanfranco, 2006).
Lo scambio di nutrienti
Alla base della simbiosi AM c'è lo scambio reciproco di nutrienti. I funghi AM dipendono quasi totalmente dalla pianta ospite per quanto riguarda l'acquisizione del carbonio. Dalla pianta ricevono, in frazione significativa (tra il 4% e il 20% a seconda dei partner coinvolti), composti originati dal processo fotosintetico (Smith e Read, 1997). Alcuni studi hanno ipotizzato la presenza, nei funghi AM, di "lesioni" nei percorsi metabolici legati al carbonio (C), le quali sembrano essere la causa principale del biotrofismo obbligato di questi organismi. In particolare è stato osservato che sia le ife extraradicali che le spore germinanti non sono in grado di sintetizzare catene di acidi grassi a 16 unità di carbonio; la sintesi di queste molecole avviene esclusivamente nella fase intraradicale (Trépanier et al., 2005). Altri studi hanno dimostrato che il fungo non riesce ad accumulare lipidi durante la fase asimbiotica (Bago et al., 1999) e che esso preleva carbonio, probabilmente sottoforma di esosi, esclusivamente all'interno della radice (Shachar-Hill et al., 1995; Solaiman e Saito, 1997; Bago et al, 2003).
Tra i molteplici benefici che la pianta riceve dal fungo AM, primo fra tutti è l'approvvigionamento di nutrienti minerali. Il fungo è in grado di trasferire alla pianta elementi minerali come fosforo (Pearson e Jacobsen, 1993), azoto (Subramanian e Charest, 1998), potassio, zinco (Kothari et al, 1991) e rame, grazie alla sua fitta ed estesa rete miceliare, che va al di la della zona di deplezione radicale (zona che si viene a creare a causa dell'elevata velocità di assorbimento di nutrienti da parte delle radici rispetto alla velocità di diffusione degli elementi minerali). La maggior parte degli studi condotti in passato si sono focalizzati sullo studio del trasferimento del fosfato (P), sia attraverso l'analisi del contenuto di P nei tessuti delle piante, sia per mezzo di isotopi radioattivi (Ratti et al., 2001; Yao et al., 2001; Joner et al., 2000b; Ramesh et al., 2000). Finora sono stati isolati geni codificanti trasportatori del P in tre funghi AM Glomus versiforme, G. intraradices e G. mosseae (Harrison e van Buuren, 1995; Maldonado-Mendoza et al., 2005; Benedetto et al., 2005). A dimostrazione del coinvolgimento di questi trasportatori nell'assorbimento di P dal suolo, è stato evidenziato che i trascritti di questi geni sono presenti a livello extraradicale, anche se in G. mosseae è stata osservata un'espressione anche a livello intraradicale (Benedetto et al., 2005; Balestrini et al., 2007). Parallelamente, indagini a livello di piante ospiti hanno portato all'identificazione di geni codificanti trasportatori del P che sono espressi in modo specifico nelle cellule che contengono gli arbuscoli e che pertanto dovrebbero essere responsabili dell'assorbimento di P rilasciato dal fungo (Javot et al., 2007a). Per approfondimenti sull'argomento si rimanda a eccellenti articoli di revisione pubblicati di recente (Bucher 2007; Javot et al., 2007b).